Artículo publicado en Informe ALAC Ciencia y Ética, Año XXI, Número 2
Biomarcadores Genéticos de Aplicación Clínica

(Buenos Aires).- El desarrollo de nuevas tecnologías y la mejora en los costos de las mismas ha permitido un gran avance en la aplicación clínica de estos ensayos en distintos campos de la Genómica y la Medicina de Precisión.

En los últimos años los cambios han sido vertiginosos no solo por el impacto del valor médico de estas prácticas sino por la diversidad de patologías y campos de aplicación de los mismos.
En este contexto, nos pareció muy oportuna la realización de un curso que permitiese volcar la experiencia local en el desarrollo, puesta a punto clínica y validación de estas herramientas en distintos campos de la Medicina que hoy ayudan a resolver en nuestro país problemas complejos que hasta hace poco tiempo solo se resolvían en el exterior.

Este curso fue realizado en una plataforma on-line interactiva de ALAC con más de 100 inscriptos de todo el país, tanto de laboratorios de ALAC como externos a nuestra red y que luego podía ser consultada, ya sea para revisar los temas como para generar nuevas inquietudes.
El mismo se desarrolló en 10 clases de 1 hora y media durante 4 meses.
A continuación se detallan los temas desarrollados en dicho curso con la intención de promover el conocimiento de cómo aplicar los mismos en nuestra práctica diaria y lograr transformar nuestra red ALAC en un lugar donde puedan resolverse estos temas complejos.

Tecnologías aplicadas al estudio de biomarcadores moleculares

La muestra tomada en el laboratorio muchas veces representa un momento único e irrepetible del estado fisiológico del paciente. Es por esto que en el módulo se desarrollan los aspectos pre-analíticos y los cuidados que debemos tomar en esta etapa para conseguir la correcta conservación de la muestra.
Dentro de la analítica se realiza la extracción de ADN mediante unas diferentes técnicas (manuales, semiautomatizadas y automatizadas) y se utilizan métodos para evaluar la concentración y pureza del material genético obtenido.
Luego se aplican diferentes técnicas moleculares con diferentes mecanismos de detección, sensibilidad analítica y especificidad cuya elección en cada caso, depende del uso previsto y de las ventajas y desventajas de cada una para dicha aplicación.

Las diferentes técnicas que se revisaron durante el curso fueron:

  • PCR punto final
  • PCR real time (Métodos no específicos / específicos)
  • RT-PCR / PCR Nested / PCR Multiplex
  • Secuenciación Sanger
  • NextGenerationSequencing
  • MLPA
  • MicroArrays
  • La necesidad de utilizar las fortalezas de varias técnicas para arribar al diagnóstico correcto.

Se introdujo también el concepto de error total admisible, cálculo de bias% y CV%, utilización de controles internos y externos, planificación de la calidad para realizar una correcta validación técnica de los resultados, de fundamental importancia para la aplicación de estas tecnologías en el diagnóstico clínico.
También es importante hacer hincapié en la etapa post-analítica donde se analizaron la validación clínica del resultado utilizando los datos obtenidos en las etapas anteriores y la importancia de la relación médico-bioquímico.
Biomarcadores en enfermedades hereditarias

En Argentina, se estima que más de 3 millones de familias conviven con una enfermedad poco frecuente (EpoF). Durante los últimos años, gracias al advenimiento de nuevas tecnologías en el área de la biología molecular, los estudios genéticos se han transformado en herramientas de uso rutinario para el diagnóstico final de enfermedades genéticas.
Este tipo de estudios moleculares, fundamentalmente el cariotipo molecular del tipo CGH array (hibridación genómica comparativa) o estudios del tipo NGS (Next Generation Sequencing) que abarcan la secuenciación, ya sea de paneles de genes candidatos o inclusive del genoma completo, brindan información sumamente valiosa por cuanto las técnicas moleculares previamente mencionadas pueden realizarse sin una hipótesis previa de la forma de herencia de la enfermedad. Este tipo de herramientas reducen el tiempo que demora en realizarse el diagnóstico u “odisea diagnóstica”, hecho que repercute directamente en los costos de los estudios complementarios que se hubieran tenido que realizar en los familiares, de no contar a priori con el dato de la mutación portada por el paciente.

En la actualidad, entidades internacionales que nuclean profesionales en diferentes especialidades generando consenso en la comunidad médica internacional, han remarcado no sólo la importancia del resultado diagnóstico para el individuo que padece una enfermedad genética, sino para los familiares del paciente y para la sociedad misma.

Cuando es posible la identificación de la variante causal en el paciente afectado por una enfermedad genética, este hallazgo permite determinar en un alto porcentaje de casos la causa etiológica de su enfermedad como así también su prognosis y el tratamiento óptimo a ser aplicado. Por otro lado, una de las condiciones necesarias para que un paciente pueda participar en estudios clínicos es el diagnóstico definitivo de su enfermedad genética. La ausencia de un diagnóstico etiológico deja al paciente, además de sin respuesta en cuanto al origen de su enfermedad, sin información para que se puedan generar conocimientos y consensos para las investigaciones a futuro.

Finalmente, el diagnóstico definitivo de una enfermedad genética en un paciente brinda a los familiares directos, la posibilidad de realizar estudios moleculares relativamente más sencillos con el fin de identificar si son portadores o no de la misma mutación presente en el familiar afectado.

Uso de biomarcadores en medicina reproductiva

En el módulo IV se trató el uso de biomarcadores en medicina reproductiva. En el contexto de la reprogénetica, término adaptado para describir todos aquellos mecanismos genéticos involucrados en el proceso de reproducción, se hizo hincapié en las distintas etapas de la concepción en donde la genética tiene injerencia.

En la etapa preconcepcional, se ofrecen desde el laboratorio distintos tipos de tests. Por ejemplo, el screening de enfermedades hereditarias recesivas, donde se evalúan distintas mutaciones que tienen impacto en la calidad de vida, en forma moderada o grave y que tienen un aumento de su incidencia en ciertas poblaciones (por ejemplo: fibrosis quística, atrofia muscular espinal, etc). Este test se ofrece tanto a progenitores que quieren conocer su estado de portador antes de la concepción, así como también en centros de fertilidad para mujeres ovodonantes. Como parámetro de salud reproductiva de la mujer, se puede estudiar la receptividad del endometrio, lo que permite determinar la ventana de implantación para cada paciente y establecer en función del resultado una transferencia de embriones personalizada.

En la etapa preimplantacional, se debe realizar una biopsia al embrión para poder estudiarlo. Los estadíos donde se toma la muestra son dos: en estadío de blástula (día 3) y de blastocisto (día 5). El screening genético preimplantacional (PGS) tiene como objetivo seleccionar embriones euploides. Distintos estudios han demostrado su utilidad en madres añosas o abortadoras recurrentes, ya que aumenta la tasa de implantación y de embarazo. Otra aplicación en esta etapa es el diagnóstico genético preimplantacional (PGD), donde a priori se conoce la mutación que se quiere buscar y se selecciona aquel embrión sano para una determinada enfermedad o anomalía previamente caracterizada en los progenitores o familiares. Ya en la etapa prenatal, se conocen principalmente dos tipos de tests. Los de carácter invasivo como son la amniocentesis, biopsia corial y cordocentesis. Estos tipos de procedimientos están indicados cuando el riesgo genético es mayor al riesgo que tiene la prueba invasiva per se. Es por ello que se los recomienda a pacientes cuyo screening del primer trimestre les dio un riesgo elevado o se detectaron malformaciones en la ecografía. Por otro lado, mujeres embarazadas se pueden realizar a partir de la semana 9 de gestación el test prenatal no invasivo o NIPT (del inglés Non Invasive Prenatal Test). Este test surge debido al descubrimiento en 1997 por Lo y cols de la presencia de ADN circulante de origen fetal en plasma materno. Es decir que a través de una extracción de sangre materna, se pueden detectar con un alto valor predictivo positivo las trisomías más comunes (T21, T13 y T18).

En la etapa postnatal, donde la situación es más sencilla desde el punto de vista de la interpretación y el asesoramiento, el tipo de muestra a analizar no es una limitante, y el abanico de estudios que se pueden realizar es mucho más amplio, Desde un cariotipo, FISH, CGHarray, PCA para identificar una mutación puntual, secuenciación por Sanger para estudiar genes pequeños hasta NGS para el estudio de paneles de genes, exomas y/o genomas completos. En función de la sospecha clínica y la anomalía/mutación que se quiera buscar son la tecnología y la técnica a utilizar.
Por último, la etapa pre y post test de asesoramiento genético son consideradas las de mayor importancia. Es aquí donde se debe realizar el encuadre diagnóstico, establecer la forma de herencia y el riesgo familiar, informar sobre los alcances y limitaciones del test, ayudar a la toma de decisión de forma informada y mantenerse siempre en el marco ético, de la verdad-privacidad, confidencialidad, no directividad, equidad y voluntariedad.

Biomarcadores en oncología y enfermedades hematológicas

El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial, En los últimos años, los avances en este área, han experimentado un gran desarrollo, poniendo de manifiesto la existencia de una gran variedad de alteraciones moleculares involucradas en la carcinogénesis y en la adquisición de un fenotipo tumoral más o menos agresivo, siendo fundamental el uso de biomarcadores que permitan diagnosticar, hacer pronóstico, seleccionar un tratamiento, medir la eficacia y monitorear la respuesta terapéutica, y hacer un seguimiento posterior.

Aplicaciones concretas en los casos de tumores sólidos incluyen biomarcadores predictivos, indican la posibilidad de respuesta a un determinado tratamiento, ejemplos de ellos son: EGFR y ALK en cáncer de pulmón, BRAF en melanoma, KRAS y BRAF en cáncer de colon; biomarcadores pronóstico, permiten mejorar la valoración para la elección de un tratamiento más o menos agresivo y de un seguimiento más o menos estrecho, como por ejemplo BRAF V600E en cáncer papilar de tiroides; biomarcadores de riesgo, se estudian en población general o subpoblaciones de alto riesgo, e indican una mayor o menor susceptibilidad para desarrollar la enfermedad, como ser los genes BRCA1/2 en familiares de pacientes con cáncer de mama hereditario.

En los casos de enfermedades hematológicas también existen biomarcadores con una aplicación concreta. En el caso de la leucemia mieloide crónica, el oncogén BCA ABL es el biomarcador que permite diagnosticar y monitorear respuesta terapéutica, mientras que en el grupo de neoplasias mieloproliferativas crónicas Ph (-) clásicas, el estudio del estado mutacional de los genes JAK2, CALR y MPL, contribuyen a la evaluación de dichas patologías. Estos son solo algunos ejemplos de biomarcadores que se usan actualmente, pero el portfolio se amplía cubriendo un gran abanico de enfermedades oncohematológicas.

Biomarcadores y farmacogenómica

Las diferencias en respuesta a tratamientos con medicinas difieren ampliamente entre individuos de una misma población,
Esto es resultado de diversos factores, siendo uno de los principales, el background o perfil genético.

El término farmacogenética, establecido hace más de 50 años, define a la disciplina biológica que estudia las bases genéticas del metabolismo y respuesta a fármacos.
Previo a la indicación del tratamiento de algunos fármacos, la realización de estudios genéticos permite, en teoría, la selección de aquellos pacientes que se beneficiarían por el uso, de aquellos otros que no experimentarían beneficios o inclusive, que pudieran llegar a experimentar efectos adversos debido al uso de los mismos.
Algunos ejemplos de este tipo de estudios farmacogenéticos que se incluyen rutinariamente en la clínica son: genotipificación del gen CYP2D6 para tratamiento con tamoxifeno en pacientes diagnosticados con cáncer de mama estrógeno-dependiente y genotipificación de los genes DPYD y UT-G1A1 para pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal en tratamiento con citostáticos (5-Fluorourasilo, oxaliplatino e irinotecan).

En la actualidad, numerosos ensayos clínicos -fundamentalmente en el área de la oncología -se apoyan en este tipo de estudios para la evaluación de nuevas medicinas. La incorporación de estudios farmacogenéticos en la selección de participantes, permite que el N de los mismos sea significativamente menor, siendo la selección de los participantes no solo basada en función de su diagnóstico clínico sino también en función de su perfil genético asociado a la presencia o no de variantes involucradas en el metabolismo del fármaco a estudiar.
Contar con esta información permite la identificación y selección de pacientes con características clínicas similares pero portadores de un perfil genético característico -ya sea presente en su ADN o en el del tumor desarrollado.

Microbioma

El cuerpo humano alberga gran cantidad de microorganismos en diferentes sitios, cuya abundancia excede al número de células humanas en por lo menos diez veces. Este conjunto de microorganismos íntimamente integrados con el ser humano es lo que se denomina microbioma. El advenimiento de la tecnología de secuenciación masiva de segunda generación permitió un análisis mucho más extenso de estas comunidades que no hubiera sido posible describir mediante las técnicas microbiológicas convencionales.

Actualmente, se sabe que el microbioma varía según distintos factores como la edad, sexo, medio ambiente, dieta o enfermedad, e influye en procesos relacionados con el desarrollo, la nutrición, la inmunidad y la resistencia a patógenos, entre otros. Existen estudios que involucran variaciones en el microbioma (o disbiosis), con gran cantidad de enfermedades que van desde desórdenes gastrointestinales, como el Síndrome de colon irritable, hasta problemas inmunológicos, obesidad, diabetes o trastornos neurológicos como depresión o autismo.

La naturaleza del microbioma está siendo cada vez más comprendida a través de grandes proyectos como el Human Microbiome Project, auspiciado por el NIH que analizó el microbioma de 18 sitios en 242 voluntarios o el MetaHIT que es un consorcio europeo que analizó el microbioma intestinal, entre otros. Como signo claro de la importancia de este tema y la necesidad de manejar datos serios acerca del microbioma, en mayo de este año la Casa Blanca anunció el programa denominado NationalMicrobiomeInitiative, con una inversión millonaria de parte del sector público y el privado, para hacer estudios certeros sobre este tema.

Se ha demostrado que el microbioma es altamente dinámico y que está influenciado por gran variedad de factores, entre los que están las diferencias geográficas. En este sentido, se llevó a cabo el primer estudio del microbioma a nivel local mediante un proyecto conjunto entre Cibic e Indear cuyo objetivo fue evaluar la composición del microbioma de la población sana argentina y compararlo con la base de datos generadas por el HMP en EE.UU. Se tomaron muestras de diferentes sitios corporales de 20 individuos sanos. Se estudió el microbioma de fosas nasales, bucal, amígdalas, saliva, intestino y garganta y se determinó que su composición taxonómica se condecía con lo que se estaba observando a nivel mundial para poblaciones humanas. Al comparar la composición del microbioma de estos sitios con los de EE.UU. se observaron diferencias en la abundancia de las familias taxonómicas más predominantes, remarcando la necesidad de contar con datos de la población local. Como una ampliación de este proyecto, actualmente estamos llevando a cabo el Proyecto Microbioma Gastrointestinal y Metaboloma, que nos va a permitir estudiar de forma más global el microbioma gastrointestinal específicamente y el metaboloma de 200 individuos sanos de distintas regiones urbanas de Argentina. Esto constituirá la primera base de datos en Argentina de una población local sana necesaria para poder luego comenzar a estudiar el microbioma en disbiosis.

El hecho de que el microbioma sea dinámico y que pueda modificarse mediante el uso de prebióticos sumado a los conocimientos cada vez más crecientes de la asociación entre disbiosis y enfermedad, lleva a buscar terapias que modulen la composición del microbioma para tratar las enfermedades asociadas de manera precisa y personalizada, lo que llamamos medicina de precisión. En este sentido, ya hay empresas que apuntan al diseño de prebióticos y probióticos para tratar algunas disbiosis del microbioma.
Vemos un futuro donde la combinación de la información del genoma de una persona junto con el microbioma puedan usarse para predecir el mejor tratamiento para los pacientes, permitiendo una terapia a medida.

Biomarcadores en infectología

En este módulo se revisaron los biomarcadores que se pueden estudiar en el laboratorio de Biología Molecular asociados al Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) y las Hepatitis virales B y C (HBV y HCV). Durante el módulo se definieron los conceptos de Medicina Clásica y Medicina Personalizada. La Medicina Personalizada surge a partir de la interpretación en conjunto de diferentes biomarcadores estudiados sobre el agente infectante y el huésped o paciente. La utilización de estos biomarcadores permite estudiar a cada infección de manera personalizada obteniendo tanto beneficios en la salud del paciente como reducción de los costos asociados a cada patología. En el módulo repasamos el uso de los biomarcadores en el diagnóstico, en la evolución de la historia natural de la infección y en la elección del correcto tratamiento del paciente a partir de la predicción de la respuesta al mismo. Además, evaluamos el uso de diferentes biomarcadores asociados al monitoreo del tratamiento para detectar las fallas y corregir a tiempo. Entre los biomarcadores del agente infectante incluidos en este módulo del curso, se encuentra la carga viral utilizada como biomarcador en el diagnóstico, en la evolución de la infección y en el monitoreo del tratamiento. Luego repasamos el genotipo viral, presente en la elección del tratamiento y la predicción del mismo, para ambas hepatitis virales. También los test de resistencia a antivirales y el test de tropismo, utilizados para la correcta elección del tratamiento y la evaluación de la falla al mismo. Por último, entre los biomarcadores asociados al huésped destacamos la utilidad de la detección del alelo HLAB5701 como predictor de hipersensibilidad al Abacavir; una droga antiviral contra el VIH; los polimorfismos en el gen de la Interleucina 28B asociados a curación espontánea y predictores de repuesta al tratamiento con Interferón y Ribavirina en la infección crónica con VHC; y los polimorfismos en el gen ITPA, asociados a anemia por Ribavirina. Estos dos últimos, ejemplos clásicos de la aplicación de biomarcadores genéticos utilizados en las infecciones por agentes virales. Por último, evaluamos el cambio de paradigma en el tratamiento de la Hepatitis C y el escenario cambiante que el mismo plantea.

Por un lado, el cambio de paradigma que implica salir del modelo clásico donde el médico conoce el alcance del test que solicita, el financiador su costo y el bioquímico realiza el mismo entregando un resultado como una interpretación única a un nuevo contexto.

Este nuevo contexto, implica nuevas interacciones:

  • Una interacción entre el médico y el bioquímico en el diseño de la mejor estrategia costo-efectiva para el caso
  • Entender que en muchos casos se sale del concepto paciente-individuo para pasar al concepto paciente-familia, en donde no siempre el paciente que consulta al médico es el caso índice que deba analizarse (ejemplo: cáncer, enfermedades hereditarias)
  • El financiador no siempre comprende el alcance del test y como test de mayor costo puede redundar en menores tiempos y mayor costo-efectividad por lo que obliga a los bioquímicos a introducirse en estos temas para explicar la elección del test propuesto
  • Entender que en muchos casos, el resultado es abierto. Lo que implica que la información generada puede o debe ser reanalizada en función de nuevos hallazgos científicos y/o clínicos
  • Incorporar el proceso del consentimiento informado al paciente/familia con amplia explicación sobre los alcances del test y lo que podrá obtenerse del mismo.

Por otro lado se explicó la importancia del desarrollo local de estos test ya que permiten generar valor propio en nuestro país para su aplicación ya sea a nivel científico como clínico y por otro lado porque permite que la información generada sea accesible para el médico y el paciente ante nuevos hallazgos.

Agradecemos la colaboración de la Fundación ALAC y a todos los participantes por la excelente colaboración recibida durante el curso.
Dr. Fabián Fay

Docentes

  • Dra. María Sonia Baquedano
    Bioquímica. Doctora en Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Buenos Aires
    Investigadora del CONICET. Laboratorio de Endocrinología Molecular Básica. Hospital Nacional de Pediatría J.P Garrahan. Asesora del Área Biología Molecular, CIBIC (Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad S.A.)
  • Lic. EzequlelZubillaga
    Licenciado en Biotecnología. Líder del Área Biología Molecular, CIBIC (Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad S.A.)
    Analista del Área Control de Calidad y Bioseguridad, CIBIC (Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad S.A.)
  • Dra. Florencia Gosso
    Bioquímica. PhD de VrijeUniversiteitAmsterdam, Países Bajos. Supervisora del Área Biología Molecular, CIBIC (Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad S.A.)
  • Lic. Guadalupe Méjico
    Licenciada en Biotecnología. Líder del Área Biología Molecular, CIBIC (Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad S.A.)
  • Lic. Analía Seravalle
    Licenciada en Biotecnología. Responsable del Área Biología Molecular, CIBIC (Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad S.A.)
  • Lic. Javier Sfalcin
    Licenciado en Biotecnología. Supervisor del Área Biología Molecular, CIBIC (Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad S.A.)
  • Dra. Mariela Sciara
    Bioquímica. Doctora en Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Rosario.
    Supervisora del Área Biología Molecular, CIBIC (Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad S.A.)

Fuente. FABA Informa